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蛋白質(zhì)凝膠電泳凝膠的制備方法
發(fā)布時間: 2021-09-02  點擊次數(shù): 1045次

蛋白質(zhì)凝膠電泳凝膠的制備方法

        【材料與試劑】
         (1) 30%丙烯酰胺:稱取29g丙烯酰胺、1g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和60ml溫去離子水,加熱至37℃溶解,加水至終體積100ml,過濾,然后制備30%(w /v) 丙烯酰胺儲存溶液。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在儲存過程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸。這種脫氨基反應是光催化或堿催化的。因此,溶液的pH值不應超過7.0,并應在4°C下儲存在棕色瓶中。
         (2) 10%十二烷基硫鈉(SDS):稱取10g SDS,加入去離子水90ml,加熱至68℃,加幾滴濃鹽酸調(diào)至pH7.2,加水至100ml,即 10% (W/v) SDS。
         (3)濃縮凝膠緩沖液(1mol/L Tris-HCl pH 6.8):12.12g Tris溶于80ml去離子水中,用濃鹽酸調(diào)至pH 6.8,再加入去離子水至100ml。儲存在 4°C。
         (4)分離凝膠緩沖液(1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8):將18.16g Tris溶于80ml去離子水中,用濃鹽酸調(diào)pH至8.8,再加入去離子水至100ml。儲存在 4°C。
         (5) 10%過硫酸胺(AP):過硫酸胺提供催化丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。少量 10% (W/V) 可用去離子水配制 保存溶液并在 4°C 下保存。由于過硫酸胺分解緩慢,應每隔一周新鮮配制一次。
         (6) TEMED (N, N, N, N-四甲基乙二胺) TEMED通過催化過硫酸胺形成自由基來加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合。因為TEMED只能以游離的堿形式起作用,所以pH值低時聚合反應受到抑制。
         (7) Tris-甘氨酸電泳緩沖液:分別稱取15.1g Tris和94g甘氨酸,溶于900ml去離子水中,再加入50ml 10%(w/v)SDS,再加入去離子水至1000ml變?yōu)??存儲解決方案。使用時稀釋5倍,Tris終濃度為25mmol/L,甘氨酸為250mmol/L,0.1% SDS,緩沖液pH為(8.3)。
         (8)聚丙烯酰胺凝膠電泳槽及電泳儀
        (9) 取樣器及吸頭等。
         【操作方法】
         (1) 按照立式電泳槽說明書安裝玻璃板,并確保配制分離凝膠的濃度和體積,按照《Tris-制備溶液》中所列組分配制所需的分離膠。甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠"(見書末附錄);
         (2)將分離膠快速注入兩塊玻璃板之間的縫隙中,留出澆注膠合膠的空間(梳齒長度加1cm,用滴管小心地將分離膠蓋上一層0.1% SDS(丙烯酰胺濃度小于8%時)或異丁醇或水(丙烯酰胺濃度≥10%時),覆蓋層可以防止氧氣擴散到凝膠中,抑制聚合反應。室溫下垂直凝膠;
         (3)分離膠*聚合后,倒出覆蓋層液體,用去離子水多次沖洗凝膠頂部以去除未聚合的丙烯酰胺,盡可能去除凝膠上的液體;
         (4)確定要制備的濃縮膠體積,按“制備Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液"配制所需的濃縮膠,然后將濃縮膠直接倒在分離膠上,立即插入清潔配套梳子以避免氣泡,然后加入濃縮凝膠溶液以填充梳子之間的空間。濃縮凝膠聚合后,拔出梳子,形成樣品孔;
         (5)將Tris-甘氨酸電泳緩沖液用去離子水稀釋5倍,倒入電泳槽中,填滿樣品孔,此時樣品孔中的氣泡可通過電泳緩沖液消除。

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